Zellen bedampfen - Im Interview mit CULTEX

Interview mit CULTEX Laoratories aus Deutschland

Dass es der Lunge so gut wie sofort besser geht, wenn sie bedampft statt eingequalmt wird, kann jeder Dampfer bestätigen. Doch welche Auswirkungen Liquid-Aerosol ganz spezifisch auf menschliche Lungen und Bronchialzellen hat, das ist eine zweite Frage. Das CULTEX Labor in Hannover hat sich auf entsprechende in vitro Versuche spezialisiert, bei denen unter anderem die Reaktion menschlichen Zellgewebes auf E-Zigaretten-Dampf analysiert wird.

Liquid-News hat sich mit Stefanie Scheffler von CULTEX über die Potenziale und Grenzen dieser Art der Risikobewertung unterhalten.

LN: CULTEX ist auf die Erforschung von Aerosol-Einwirkung auf den menschlichen Organismus durch in-vitro Untersuchungen spezialisiert – dazu gehört auch der E-Zigarette-Dampf. Was hat die beiden Gründer zu diesem Forschungs-Fokus motiviert?

CULTEX: Die direkte Analyse von luftgetragenen Stoffen war zu dem Zeitpunkt, als unsere Firmengründer sich mit dieser Thematik befasst haben, noch ein wenig erforschter Bereich. Bis dato wurden luftgetragene Stoffe jeglicher Art getestet, indem aus ihnen Extrakte hergestellt und diese dann auf die Zellen gegeben wurden.

Dieser Testansatz hat jedoch einige Einschränkungen. Zum Einen sind im Extrakt flüchtige oder wasserunlösliche Komponenten nicht enthalten, partikuläre Substanzen können in Lösung sogar ihre Eigenschaften verändern. Zum Anderen entspricht das Versuchsszenario nicht der tatsächlichen Situation in der Lunge, so dass möglicherweise einige Aspekte nicht erfasst werden.

LN: Können Sie uns einen kurzen Überblick über die diesbezügliche Expertise Ihres Teams geben?

CULTEX:Seit 1999 arbeiten unsere Firmengründer auf dem Gebiet der Inhalationstoxikologie, seit 2007 existiert die Firma Cultex Laboratories. Unser Team arbeitet tagtäglich mit eigens von uns entwickelten Expositionsmodulen, zum Beispiel mit Gasen, Aerosolen, Partikeln oder anderen luftgetragenen Stoffen. Das heißt, wir verfügen über jahrelange Erfahrung in der Exposition von Zellkulturen und verbessern unsere Module entsprechend den experimentellen Anforderungen.

LN: Für Ihre Untersuchungen nutzen Sie Zellen des menschlichen Respirationstraktes (Lunge, Bronchen). Entstammen diese gesundem Gewebe oder werden die Zellen eher im Umfeld von bereits erkrankten Spendern gewonnen? Welche Zellarten werden dabei verwendet?

CULTEX:Unsere Zellen werden Patienten entnommen, die sich aufgrund einer Erkrankung einer Operation unterziehen müssen. Dies sind häufig Krebspatienten. Allerdings werden die Gewebestücke, die wir verwenden, aus einiger Entfernung zum kranken Gewebe entnommen und vor der Zellisolation noch einmal auf krankhafte Veränderungen untersucht. Die Gewebestücke, die wir letztendlich erhalten, zeigen keinerlei krankhafte Veränderungen.

LN: Wie können wir uns den praktischen Ablauf einer solchen Untersuchung vorstellen? Speziell scheint dabei die sogenannte Air-Liquid-Interface (ALI) Kulturführung zu sein, die die tatsächlichen Bedingungen in der Lunge besonders realistisch nachbildet. Können Sie uns das erklären? Wie unterschiedet sich dieses Vorgehen von anderen in-vitro Verfahren?

CULTEX: In unseren Untersuchungen legen wir viel Wert darauf, die tatsächliche Situation in der Lunge zu simulieren. Deshalb werden die Lungenzellen in unseren Versuchen nicht, wie in anderen Versuchsanordnungen, einfach mit einem Extrakt des Liquid-Dampfes bedeckt, sondern direkt bedampft. Das bedeutet, dass die Zelloberfläche direkt der umgebenden Atmosphäre ausgesetzt ist. Dies bezeichnen wir als Kultivierung an der „Air-Liquid-Interface“.

Realisieren lässt sich dies, indem die Zellen auf einer Membran kultiviert werden, die es erlaubt, die Zellen von der Unterseite zu „füttern“, so dass an der Zelloberfläche kein Medium vorhanden ist. Bei traditionellen in vitro Tests werden die Zellen auf einer Plastikoberfläche kultiviert und sind mit Nährmedium bedeckt. So können die Zellen nicht direkt bedampft werden, da der Dampf die Zellen nicht erreichen würde. Daher wird ein Extrakt aus dem Dampf hergestellt, welches dann auf die Zellen gegeben wird. Dies spiegelt aber eben nicht sie Situation in der Lunge wieder, da die Zellen dort nicht von einer derartigen Flüssigkeitsschicht bedeckt sind.

LN: Welche potenziellen Zellveränderungen beziehungsweise toxischen Wirkungen lassen sich im Falle von Liquid-Aerosol untersuchen?

CULTEX: Es lässt sich hier zwischen zwei unterschiedlichen Szenarien unterscheiden: Der akuten und der chronischen Toxizität. Die akute Toxizität wird meist an frisch ausgesäten, sich teilenden Zellen untersucht. Das spiegelt die Situation in der Lunge wider, wie sie nach Verletzungen oder Infektionen zu finden ist. Diese Zellen sind besonders empfindlich und zeigen somit deutlich, ob die getestete Substanz ein toxisches Potential besitzt. Wird ein entsprechender Effekt beobachtet, können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, die sich mit der chronischen bzw. Langzeitschädigung befassen.

Dazu werden differenzierte, also voll entwickelte Zellen verwendet, die eine Kultur ausbilden, die dem Lungengewebe im menschlichen Körper gleicht. Diese Kulturen werden dann mit nicht-toxischen Konzentrationen behandelt, um zu sehen, wie sich eine wiederholte Exposition auswirkt. Im Falle von Zigarettenrauch zum Beispiel können wir in der Zellkultur sehen, dass nach wiederholter Exposition die Flimmerhärchen (Zilien) der Zellen verschwinden. Dies lässt sich auch beim gesunden Raucher beobachten und ist verantwortlich für den Raucherhusten.

LN: Die Geräte, mit denen die menschlichen Zellkulturen den Aerosolen ausgesetzt werden, hat CULTEX selbst entwickelt. Können Sie uns etwas zum Aufbau und den Besonderheiten dieser Systeme sagen?

CULTEX: Unsere Expositionsmodule werden speziell für die bereits erklärte direkte Exposition an der „Air-liquid-Interface“ entwickelt. Die ersten Module sind bereits 1999 entwickelt und seitdem immer weiter verbessert worden. Hatten die ersten Module noch eine lineare Anordnung, sind die Zellkulturen in den aktuellen Modulen radial, also kreisförmig, angeordnet. Dies gewährleistet eine deutlich gleichmäßigere Verteilung der luftgetragenen Stoffe (z.B. Dampf) auf den Zellen. Der Dampf wird durch einen zentralen Einlass in das Modul geleitet und dann in 3-6 (je nach Modul) Teilströme aufgeteilt. Der Dampf wird über die Zellen geleitet und mit Hilfe einer Vakuumpumpe wieder abgesaugt, so dass ein kontinuierlicher Strom über die Zellen geleitet wird – so wie es auch in der Lunge der Fall ist.

LN: Könnten Sie sich vorstellen, dass CULTEX-Geräte zu einem Branchenstandard für die Risikobewertung einzelner Liquid-Aerosole werden? Gibt es diesbezüglich Gespräche im Umfeld der gerade angängigen Standardisierungsbemühungen der Bundesregierung bzw. Normierungsorganisationen auf EU-Ebene?

Die in vitro Testung in Kombination mit einer chemischen Analyse des Dampfes wäre ein sehr gutes Modell für die Risikobewertung, ist heutzutage aber noch kein technischer Standard. Neben den Cultex-Geräten gibt es aber noch einige andere Anbieter für Expositionsmodule auf dem Markt. Hier ist in erster Linie das Prinzip zu verfolgen. Gespräche darüber gibt es mit offiziellen Stellen derzeit noch nicht.

LN: Braucht es zur Nutzung ein vollständiges Laborumfeld oder könnten Ihre Apparaturen zum Beispiel auch von Herstellern selbst für Testzwecke eingesetzt werden?

CULTEX: Unsere Module selbst sind sehr einfach zu betreiben, es werden nur eine Vakuumpumpe und sogenannte Massenflußregler benötigt, die die Luftströme über den Zellen kontrollieren. Allerdings braucht man weiterhin einen „Rauchroboter“, der die E-Zigarette dampft und vor allem die Zellkulturen. Und die sind dann der limitierende Faktor, da ein Zellkulturlabor einiges an Equipment benötigt – und auch Personal, dass sich mit der Anzucht von Zellen auskennt.

LN: Wie finanzieren sich die Studien beziehungsweise woher kommen vor allem die Anfragen hinsichtlich E-Zigarettendampfes?

CULTEX: In erster Linie finanzieren sich unsere Studien über den Verkauf unserer Gerätschaften. Neben unseren Expositionsmodulen haben wir auch weitere Geräte wie z.B. Module zur automatisierten Langzeitkultivierung von Zellen oder Gerätschaften zur Erzeugung von Partikelaerosolen im Programm. Außerdem verkaufen wir unser Know How und unsere Infrastruktur, d.h. wir arbeiten im Auftrag der Industrie, darunter Pharma-, Kosmetik- oder Zigarettenindustrie. Die Studien zur E-Zigarette, die wir derzeit durchführen, sind jedoch nicht in Auftrag gegeben worden und fremdfinanziert, sondern reine Eigenforschung.

LN: Für viele Dampfer ist die Vorstellung, dass ihre Sicherheit durch Tierversuche gewährleistet werden soll, schwer erträglich. Kann die in-vitro Forschung Tierversuche ablösen? Wie steht die Gesundheitsbehörden zu diesem Thema? Glaube Sie, dass in-vitro Toxizitäts-Tests von E-Liquid-Aerosol als Zulassungsstandards ausreichen können?

CULTEX: Sowohl die in vitro Forschung als auch die Forschung am Tier haben ihre Limitationen. In vitro lassen sich immer nur gewisse Teilaspekte darstellen, nicht aber der gesamte Organismus. Im Falle der E-Liquid-Testung bedeutet dies, dass wir sehr gut abbilden können, was in der Lunge passiert, jedoch nicht, welche Auswirkungen die Komponenten auf z.B. das Herzkreislauf-System oder auf das Suchtverhalten einer Person haben.

Im Tierversuch lassen sich auch einige Aspekte gut darstellen, allerdings ist z.B. gerade die Zellzusammensetzung in der Lunge eines Nagetiers (welches ja häufig für die entsprechenden Tests verwendet wird) deutlich anders als beim Menschen.

Im Zusammenhang mit der REACH-Verordnung wird an vielen Stellen daran gearbeitet, in vivo (Tierversuche) durch in vitro Tests zu ersetzen. Substanzen, die im Verdacht stehen, Hautreizungen hervorzurufen, werden heute beispielsweise schon in vitro an Hautmodellen untersucht. In Bezug auf e-Liquids kann die in vitro Testung in jedem Fall genutzt werden, um gewisse Komponenten für die Verwendung zu sperren oder Empfehlungen z.B. bzgl. der maximalen Verdampfertemperatur zu geben.

LN: Ihre erste Studie zum Thema E-Zigaretten Aerosol („Evaluation of E-Cigarette Liquid Vapor and Mainstream Cigarette Smoke after Direct Exposure of Primary Human
Bronchial Epithelial Cells“) wurde soeben veröffentlicht. Können Sie uns die Ergebnisse nochmals kurz zusammenfassen?

CULTEX: Wir haben in unserer Studie primäre humane Bronchialepithelzellen mit E-Liquid-Dampf zweier unterschiedlicher Liquids (0 % Nikotin und 2.4 % Nikotin) exponiert. Im Vergleich dazu haben wir Zigarettenrauch und Dampf der Trägerstoffe Glycerin (VG) und Propylenglycol (PG) getestet.

Nach der Exposition mit E-Liquid Dampf von 200 Zügen haben wir eine zelltoxische Wirkung feststellen können, die im Vergleich zu Zigarettenrauch-exponierten Zellen jedoch 4.5-8 mal geringer war. Interessanterweise konnten wir keinen Unterschied zwischen dem nikotinhaltigen und dem nikotinfreien Liquid feststellen. Daraus folgern wir, dass das Nikotin keine zelltoxische Wirkung hat. Über weitere Effekte, wie die Suchtwirkung, können wir jedoch keine Aussage treffen.

Weiterhin haben wir festgestellt, dass Glycerin einen stärker zellschädigenden Einfluss hat als Propylenglycol. Die könnte zu einer Empfehlung bzgl. des Glyceringehalts in Liquids führen, muss aber erst durch weitere Versuche validiert werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass dies die Ergebnisse einer ersten akut-toxikologischen Studie sind. Wir müssen weitere Studien durchführen, um diese Effekte eindeutig zu belegen. Besonders im Fokus stehen dabei Langzeitstudien, die die Wirkung einer wiederholten Exposition im nichttoxischen Bereich untersuchen, da dies die tatsächliche Situation bei einem Konsument widerspiegelt.

LN: Dr Konstantinos Farsalinos ist bei einem Vortrag auf dem diesjährigen „Global Forum on Nicotine“ auch auf Ihre Studie eingegangen. Er hinterfragt dort, ob die toxikologischen Effekte nur deshalb zustande gekommen sind, weil die Zellexposition unrealistisch hoch war. Seine implizite Vermutung scheint zu sein, dass die Studie eine derartige Wirkung beweisen sollte und deshalb entsprechend designt war, statt tatsächliche Konsumbedingungen abzubilden – Zitat: „You expose the cells to as much aerosol as needed to have toxicity, so, you find toxicity by definition!! With this methodology, any chemical would be toxic. It is important to use predefined protocols (e.g. ISO 10993-5) which determine levels of exposure.“ Wie stehen Sie zu dieser Kritik?

CULTEX: Ich habe diese Kritik gelesen und habe Dr. Farsalinos bereits diesbezüglich kontaktiert. Leider war ich nicht in Warschau beim GNF, so dass ich keine Gelegenheit hatte, diese Missverständnisse aus dem Weg zu räumen. Selbstverständlich haben wir eine Dosis verwendet, bei der wir einen Effekt beobachten konnten, der sich mit unserer analytischen Methodik gut nachweisen ließ.

Allerdings haben wir nicht nur diese eine Konzentration (Zugzahl) verwendet, sondern eine sogenannte „Dose-Response-Kurve“ aufgenommen, d.h. wir haben unterschiedliche Zugzahlen (und damit Dampfmengen) verwendet und die Reaktion der Zelle untersucht. Dabei haben wir einen linearen Zusammenhang feststellen können: Bereits nach der Exposition mit 50 Zügen konnten wir einen Effekt beobachten. Des Weiteren gilt es zu bedenken, dass wir mit einer E-Zigarette gearbeitet haben, die nur eine sehr geringe Leistung hat (3.3 V, 2.2 Ohm). Die meisten Dampfer verwenden Geräte mit deutlich höherer Leistung, so dass hier durch die größere Dampfmenge stärkere Effekte zu erwarten sind.

Abgesehen von diesem Statement hat Dr. Farsalinos noch kritisiert, dass durch unsere kurzen Zugabstände und durch die Verwendung unverdünnten Glycerins Überhitzungseffekte auftreten können. Dies haben wir inzwischen in neuen Studien widerlegt (Publikation ist in Arbeit). Die von uns entdeckten Effekte sind also nicht auf die Überhitzung des Verdampfers und der damit verbundenen Bildung von unerwünschten Nebenprodukten wie Formaldehyd oder Acrolein zurückzuführen.

LN: CULTEX hat eine eigene Broschüre zum Testen von E-Zigaretten herausgegeben, in der Sie schreiben (meine Übersetzung): „Besonders Aromen können unbekannte Risiken bergen, wenn sie inhaliert werden. Ein prominentes Beispiel für so ein Aroma ist 2,3-Butandiol. Solange es als buttriger Geschmack in Süßigkeiten verwendet und oral konsumiert wird, ist es harmlos. Bei Inhalation kann es allerdings Bronchiolitis obliterans verursachen, eine ernsthafte Erkrankung, die auch als „Popcorn-Lunge“ bekannt ist.“ Haben Sie inzwischen auch spezifische andere Aromen im Verdacht, als Aerosol toxisch oder riskant zu sein, die es bei oralem Verzehr nicht sind?

CULTEX: Derzeit kann ich darüber leider keine Aussage machen, da wir uns bisher erst einmal mit grundlegenden Fragestellungen beschäftigt haben (Wirkung der Basissubstanzen, maximale Temperatur, Zugintervalle etc.) und noch keine einzelnen Aromen getestet haben.

LN: Eine schwerwiegende Herausforderung bei der Beurteilung der Folgen des E-Zigaretten-Dampfens für die menschliche Gesundheit sind fehlende Langzeitstudien. Auch die Wirkung des Liquid-Aerosols auf menschliche Zellkulturen bildet ja immer nur eine Momentaufnahme ab und vernachlässigt zudem notwendigerweise den systemischen Aspekt. Meinen Sie, es ist dennoch medizinisch vertretbar, die beobachteten Effekte „hochzurechnen“ und so eine Langzeitwirkung zu simulieren?

CULTEX: Wie ich schon erwähnt habe, sind Langzeitstudien ein wichtiges Instrument zur Bewertung einzelner e-Liquid-Komponenten. Dafür werden aber nicht die Effekte, die in der akut-toxischen Untersuchung festgestellt wurden „hochgerechnet“, sondern Studien mit Zellkulturen durchgeführt, die dem menschlichen Lungenepithel entsprechen. Die Effekte, die durch eine wiederholte Exposition in der Lunge auftreten, können somit sehr gut widergespiegelt werden. Natürlich können wir nicht voraussagen, wie die Wirkung auf den gesamten Organismus ist, aber das ist auch nicht die Anforderung an unsere Tests. Wir wollen darstellen, was im Hauptzielorgan, der Lunge, passiert.

LN: Aus Ihrer Perspektive eines Forscherteams, wie lange würden wir unter optimalen politischen, finanziellen und wissenschaftlichen Bedingungen noch benötigen, um definitive Aussagen über das Risiko des Dampfens für den menschlichen Körper machen zu können?

CULTEX: Dies ist eine schwierige Frage, da gerade die politische Seite eine schwer zu kalkulierende Größe ist. Wir arbeiten fortlaufend an neuen Studien, haben z.B. gerade eine Versuchsreihe über unterschiedliche Maximaltemperaturen abgeschlossen und arbeiten nun an weiteren vergleichenden Studien zwischen VG und PG basierten e-Liquids sowie an einer Langzeitexpositions-Studie. Die Ergebnisse erwarten wir in den kommenden Wochen, bis zur Publikation werden vermutlich noch 2-3 Monate vergehen. In wieweit diese Ergebnisse dann aber auf regulatorischer oder Herstellerseite verwendet werden, können wir nicht beurteilen.

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